重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B及其构建方法和应用
摘要文本
本发明公开了一种重组溶瘤腺病毒OncoAd‑P28GANK‑E1A‑△E1B及其构建方法和其在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明还公开了一种肝癌特异性P28GANK启动子及其筛选方法和在制备治疗肝癌药物中的应用。本发明的P28GANK启动子具有高效的肝癌特异性，用其构建获得的重组溶瘤腺病毒OncoAd‑P28GANK‑E1A‑△E1B毒性低、抗肝癌效果好，且抗肝癌效果优于重组溶瘤腺病毒GP73‑E1A‑△E1B。
申请人信息
- 申请人:上海元宋生物技术有限公司
- 申请人地址:201415 上海市奉贤区沪杭公路1588号3幢1203-1209室
- 发明人: 上海元宋生物技术有限公司
专利详细信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 专利名称 | 重组溶瘤腺病毒OncoAd-P28GANK-E1A-△E1B及其构建方法和应用 |
| 专利类型 | 发明授权 |
| 申请号 | CN201810097442.0 |
| 申请日 | 2018年1月31日 |
| 公告号 | CN110093323B |
| 公开日 | 2024年1月30日 |
| IPC主分类号 | C12N7/01 |
| 权利人 | 上海元宋生物技术有限公司 |
| 发明人 | 章康健; 刘新垣; 方先龙; 顾锦法 |
| 地址 | 上海市奉贤区沪杭公路1588号3幢1203-1209室 |
专利主权项内容
1.一种重组溶瘤腺病毒Onco-P28GANK-E1A-△E1B，其特征在于，所述重组溶瘤腺病毒Onco-P28GANK-E1A-△E1B如SEQ ID NO：19所示的P28GANK启动子替换了腺病毒内源的E1A启动子，构建了肝癌特异性启动子P28GANK调控E1A区，同时，腺病毒基因组敲除了E1B基因区域；AdAd所述的重组溶瘤腺病毒Onco-P28GANK-E1A-△E1B通过以下步骤构建得到：Ad步骤一、以PGL3-F4质粒为模板，采用如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点Xhol到SnabI的核酸片段，即P28GANK启动子片段；其中，PGL3-F4质粒中F4的序列如SEQ ID NO：19所示；步骤二、以pZXC2质粒为模板，采用如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的特异性引物，进行PCR扩增，得到一段从酶切位点SnabI到Xbal的核酸片段，即P-E1A基因片段；步骤三、以步骤一的P28GANK启动子片段和步骤二的P-E1A基因片段为模板，采用如SEQID NO：8和SEQ ID NO：13所示的特异性引物，进行Overlap PCR，得到一段从酶切位点Xhol到Xbal的核酸片段，即P28GANK-E1A片段；步骤四、将Overlap PCR得到的P28GANK-E1A片段用XhoI和XbaI双酶切，然后与同样用XhoI和XbaI双酶切的pShuttle-pSur-E1A-△E1B质粒相连接，得到pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B；步骤五、将构建好的pShuttle-P28GANK-E1A-△E1B重组质粒用限制性内切酶PmeI线性化，去磷后转化到带有腺病毒骨架质粒pAdEasy-E3的BJ5183感受态中，使二者发生同源重组，筛选并获得阳性重组克隆的腺病毒质粒；步骤六、将阳性重组克隆的腺病毒质粒用限制性内切酶PacI线性化，转染入人胚胎肾细胞株HEK-293，获得重组溶瘤腺病毒Onco-P28GANK-E1A-△E1B。Ad