一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌及其应用

专利主权项内容

1.一种高密度发酵的低内毒素大肠杆菌，其特征在于，所述低内毒素大肠杆菌的分类命名为Escherichia coli CleanTAK 7m，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20221906，保藏时间为2022年12月09日；在CleanTAK 6α工程菌株的基础上，将构建好的各靶标基因重组pTarget质粒与融合的同源臂片段电转至CleanTAK 6α工程菌株含有pCas质粒的细胞中，构建得到CleanTAK 7工程菌株，其敲除基因组合为：ΔeptAΔkdsDΔpagPΔlpxLΔlpxPΔlpxMΔgutQ；所述CleanTAK 6α为敲除eptA、kdsD、pagP、lpxL、lpxP和lpxM基因的工程菌株；所述CleanTAK 7m工程菌株的的构建包括以下步骤：1)、pTarget-sgRNA-msbA重组质粒的构建：在msbA基因待突变位点就近寻找5’-NGG序列，以NGG序列上游31bp作为sgRNA的靶向序列，设计包含20bp且与pTarget质粒有20-25bp同源片段的下述引物：msbA-sg-IF：5’GATCTGTTTTACCAAAGCCATCATCAAGAAGGTTTTAGAGCTAGAAATA GCAAGTT 3’msbA-sg-IR：5’CGATCAACGGCACTGTTGCAAATAG 3’msbA-sg-VF：5’CTATTTGCAACAGTGCCGTTGATCG 3’msbA-sg-VR：5’TTCTTGATGATGGCTTTGGTAAAACAGATCACTAGTATTATACCTAGGAC TGAGC 3’以pTarget质粒DNA作为模板，分别进行PCR扩增构建重组质粒的插入片段与载体片段；2)、msbA基因含点突变位点片段的扩增以及融合设计两对融合PCR引物分别扩增msbA基因点突变时所需外源片段，所述引物序列如下：msbA-S1-F : 5’AAAAGTGGCACTCGCATCGG 3’msbA-S1-R : 5’CGATCTGTTTTACCAAAGCCATCATCAAGAAGTGACTTAAGGAGCGATAACATGAAGGT 3’msbA-S2-F : 5’ACCTTCATGTTATCGCTCCTTAAGTCACTTCTTGATGATGGCTTTGGTAAAACAGATCG 3’msbA-S2-R : 5’AAAACGCTTCGATACAACGC 3’其中msbA-S1-R和msbA-S2-F引物中包含已突变的碱基，即其第35位碱基由G/C替换为A/T；S1、S2片段的融合：将扩增所得的S1、S2片段各添加1μL作为重叠延伸PCR的模板，利用引物msbA-S1-F和msbA-S2-R在扩增体系下进行扩增，得到融合片段；3)、msbA基因点突变工程株的构建与鉴定将构建好的pTarget-sgRNA-msbA重组质粒与融合的外源片段电转至大肠杆菌CleanTAK 7(pCas)菌株中，涂布至含壮观霉素与卡那霉素双抗性平板上，置于30℃培养箱过夜培养；挑取单菌落划线至新的双抗平板上培养，再提取其基因组作为模板进行PCR扩增验证，PCR扩增反应是在20μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA2μL，2×高保真DNA酶预混液10μL，上游引物1μL，下游引物1μL，ddHO 6μL；所用引物序列如下：2U-msbA-F : 5’TAACGGGTAGAATATGCGGC 3’U-msbA-R : 5’CTGGCATTCCCATCATGTGA 3’将条带大小符合预期的PCR产物进行测序分析，测序结果与TAK菌株基因组进行比对，确认msbA基因成功点突变，将该工程菌株命名为CleanTAK 7m；4)、CleanTAK 7m工程菌株中质粒的消除将含pTarget与pCas双质粒的CleanTAK 7m工程菌株转接至5mL含Kan(50μg/mL)抗性的LB液体培养基中，再向其中加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导pCas质粒上的sgRNA表达，于30℃、180r/min的摇床中培养过夜，得到不含质粒的CleanTAK 7m工程菌株。