骨髓间充质干细胞的外泌体、体外培养方法以及应用
申请人信息
- 申请人:浙江双糖生物科技有限公司
- 申请人地址:315000 浙江省宁波市象山县大徐镇汤家店村工业区(自主申报)
- 发明人: 浙江双糖生物科技有限公司
专利详细信息
| 项目 | 内容 |
|---|---|
| 专利名称 | 骨髓间充质干细胞的外泌体、体外培养方法以及应用 |
| 专利类型 | 发明申请 |
| 申请号 | CN202211707328.8 |
| 申请日 | 2022/6/14 |
| 公告号 | CN117402819A |
| 公开日 | 2024/1/16 |
| IPC主分类号 | C12N5/0775 |
| 权利人 | 浙江双糖生物科技有限公司 |
| 发明人 | 王晓娟 |
| 地址 | 浙江省宁波市象山县大徐镇汤家店村工业区(自主申报) |
摘要文本
本申请公开了一种骨髓间充质干细胞的外泌体，以ELISA方法检测结果计，所述外泌体包含COLII、Cxcl9、VEGF‑A、ETS1、PDZK1、KDR、P‑KDR、CX26、CX30、CX31和CX31.1蛋白，所述外泌体不包含COLII、Cxcl9、VEGF‑A、ETS1和PDZK1相关核酸物质。进一步通过细胞试验证实了外泌体包含的上述细胞因子、促成骨分化以及血管形成的功能蛋白，具有促使成纤维细胞培养物软骨分化和血管形成的作用，提示该外泌体具有应用于医学填充、创面修复等领域的应用前景。
专利主权项内容
1.一种骨髓间充质干细胞外泌体的体外培养方法，其特征在于，包括以下步骤：获得骨髓间充质干细胞的工作种子细胞；第一传代培养：弃去所述工作种子细胞培养液中的培养基，加入PBS洗1次，替换为第一条件培养基，于37℃、5％CO条件下培养48h，得到第一代细胞；所述第一条件培养基为含有5μM 1-(5-哇啉磺酰基)-2-甲基哌嗪(H-7)、2μM地塞米松、50μg/mL抗坏血酸、10mMβ-甘油磷酸钠以及10％v/vFBS的DMEM/F12培养液；2第二次传代培养：将所述第一次传代培养得到的第一代细胞用PBS清洗1～2次，充分去除其中所述第一条件培养基后，并调整细胞浓度至106细胞数/1mL的悬液后，接种至含有80mL第二条件培养基的细胞培养瓶中，于35℃、饱和湿度、5％CO条件下培养72h，每24h换液一次，得到第二代细胞；所述第二条件培养基为含有10μM 4-甲基-5-{[(2S)-2-甲基-1, 4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、5μM 6-(环辛基氨基)喹啉-5, 8-二酮、8ng/mL转化生长因子-β以及10％v/v FBS的DMEM/F12培养液；2第三传代培养：将第二次传代培养得到的第二代细胞用PBS清洗1～2次，充分去除其中第二条件培养基后，并调整细胞浓度至106细胞数/1mL的悬液后，接种至含有80mL第三条件培养基的细胞培养瓶中，于35℃、饱和湿度、5％CO、2％O条件下培养48h，每24h换液一次，得到第三代细胞；所述第三条件培养基为1μM 4-甲基-5-{[(2S)-2-甲基-1, 4-二氮杂环庚-1-基]磺酰基}异喹啉二盐酸盐、50ng/mL转化生长因子-β、100ng/mL肝细胞生物因子、200ng/mL低氧诱导因子1α以及10％v/v FBS的DMEM/F12培养液；22以及分离外泌体：将经过上述第三传代培养的细胞培养液，用于无菌PBS洗涤后，经300×g、10min；2000×g、10min和10000×g、30min的离心程序进行差速离心后；再次100000×g离心70min，得沉淀用PBS重悬，以得到所述外泌体。。关注微信公众号马克数据网