一种血浆游离染色质的检测方法、试剂盒及其应用

专利主权项内容

1.一种获得多种器官组织特异性染色质特征的方法，其特征在于，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的，所述方法包括如下步骤：对游离染色质DNA文库进行测序，对下机数据按照进行前处理后，对公共数据库中多种组织及细胞类型进行整合分析，获得多种代表不同组蛋白修饰在染色质上共结合分布的染色质状态；其中，游离染色质DNA文库的构建方法其包括如下步骤：采用试剂盒构建待测样本的游离染色质DNA文库；采用DNA聚合酶对所述游离染色质DNA文库进行PCR扩增；所述试剂盒包括：转座体、激活转座酶活的试剂和多种载体，所述载体带有能特异性结合游离组蛋白的表位的抗体或其抗原结合片段；所述载体为抗体-磁珠复合体或抗原结合片段-磁珠复合体，所述转座体包括转座酶和接头序列；所述多种载体能够捕获多种修饰组蛋白的游离染色质；所述抗体或其抗原结合片段能特异性结合游离组蛋白，如下表位中的至少一种：第一表位、第二表位、第三表位、第四表位和第五表位；所述第一表位是组蛋白H1的表位；所述第二表位是组蛋白H2A的表位；所述第三表位是组蛋白H2B的表位；所述第四表位是组蛋白H3的表位；所述第五表位是组蛋白H4的表位；所述游离组蛋白具有翻译后修饰；所述翻译后修饰选自H3K4me1、H3K4me2、H3K4me3、H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3、H3K27me1、H3K27me2、H3K27me3、H3K36me1、H3K36me2、H3K36me3、H3K79me1、H3K79me2、H3K79me3、H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac、H3K27ac、H3K56ac、H4K5ac、H4K8ac、H4K12ac、H4K16ac、H4R3m2a、H4R3m2s、H4K20m1、H4K20m2、H4K20m3和H2AZ中的至少一种；所述激活转座酶活的试剂包括10 mM TAPS-NaOH和10mM MgCl，且所述激活转座酶活的试剂的pH为6.0-8.5；2所述试剂盒还包括第一样本洗涤缓冲液、第二样本洗涤缓冲液、消化缓冲液和消化终止液中的至少一种；所述第一样本洗涤缓冲液包括：10-100 mM Tris-HCl pH = 6.0-8.5、50-500 mMNaCl、0.1-1.0% TX-100、1-10 mM EDTA-NaOH pH = 6.0-8.5、1-100 mM去乙酰化酶抑制剂和10-500×蛋白酶抑制剂；所述第二样本洗涤缓冲液包括10-100 mM Tris-HCl pH = 6.0-8.5和1-100 mM去乙酰化酶抑制剂；所述消化缓冲液包括5-500 mM EDTA-NaOH pH = 6.0-8.5、10-100 mM Tris-HCl pH =6.0-8.5、0.01-1.0% SDS和0.1-10 mg/mL 蛋白酶；所述消化终止液包括0.1-100 mM苯甲基磺酰氟、0.01-1.0% TX-100和1-100 mM MgCl；2所述待测样本的游离染色质DNA文库的构建还包括加入建库体系；对测序数据进行前处理的方法包括如下步骤：对游离染色质DNA文库测序后的下机数据进行测序接头的去除、参考基因组定位、测序读长质量筛选及重复读长的去除；采用去接头的软件进行测序接头的去除，所述接头软件选自Cutadapt；采用Bowtie2软件进行参考基因组定位；采用Samtools和Picard进行测序读长质量筛选及重复读长的去除；使用矫正物的测序数据通过深度数据排序工具对不同样本的测序深度进行矫正，并去除批次效应；采用多变量隐马尔可夫模型ChromHMM整合公共数据库中多种器官组织染色质上的组蛋白修饰信息，并进行全基因组范围染色质模型构建，全局差异分析整合得到的多种器官组织特异性染色质特征集合；所述全基因组范围染色质模型的构建方法包括：对公共数据库中多种组织器官多种组蛋白修饰在全基因范围的共占位特征构建多变量隐马尔可夫模型，用15-20种染色质状态特征概括不同组蛋白修饰的共占位情况，基于所述多变量隐马尔可夫模型根据多种组蛋白修饰全基因组富集信息判断组织细胞及血浆游离染色质在全基因组范围每100-2000bp的染色质状态；构建全基因组范围染色质模型及通过全局差异分析整合构建所述多种器官组织特异性染色质特征集合所基于的数据库选自：ENCODE、ROADMAP和BLUEPRINT中至少一种数据库中的多种组织和细胞类型的多种组蛋白修饰；所述判断染色质状态的方法包括：采用染色体组或基因组注释工具对血浆游离染色质上以100-2000bp分辨率对多种组蛋白修饰在基因组上的分布情况进行整合，将全基因组按照100-2000bp划分为多个区域，计算每个区域判断为多种染色质状态中每一种染色质状态的概率，并以染色质状态概率最高的染色质状态注释为所述区域的染色质状态；所述全局差异分析整合包括：使用“BinarizeBed”以100-2000bp分辨率将组织细胞中每种组蛋白修饰的信号定性为0或1，使用“MakeSegment”及“-posterior”整合组织细胞类型上多种组蛋白修饰并计算得到全基因组范围每100-2000bp的染色质状态及每一种状态的可能性分值，通过“某一区域的染色质状态仅出现在某一种器官组织中，在其仅出现的组织细胞中目标区域posterior probability大于0.8-1.0，但在其他组织细胞中同一所述目标区域posterior probability小于0-0.2”的评判标准定义每一种组织细胞类型的特异性染色质状态及对应的基因组位置，整合为特征集合。。