1.本发明涉及一种鸡滑液囊支原体亚单位疫苗及制备方法及应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。


背景技术：

2.鸡滑液囊支原体病是一种由鸡滑液囊支原体(mycoplasma synoviae，ms)引起的以滑液囊及肌腱发炎，关节和实质器官肿大为特征的禽类重要疾病，此外，还可以导致青年鸡生长停滞和产蛋鸡产蛋量下降，肉鸡饲料转化率降低及胴体废弃率升高等降低鸡生产性能的问题，给家禽养殖业造成的经济损失十分严重。
3.ms是支原体科支原体属的成员，革兰染色阴性，无细胞壁，平板培养形成典型的“煎荷包蛋”状菌落，为禽类疾病的重要致病原。长期以来，抗生素疗法和疫苗接种是防治该病的主要手段。ms对某些抗生素如替米考星、氟苯尼考等敏感，但这些抗生素不能根除ms在鸡群的传播，而且长期不合理的使用抗生素对环境、畜禽和人类健康带来诸多危害。因此，疫苗接种是预防鸡滑液囊支原体病更为有效的措施。
4.目前用于防控ms感染的疫苗主要有商品化的弱毒疫苗(ms-h株)和灭活疫苗。一方面，尽管ms弱毒疫苗能有效控制ms引起的临床症状，但其苛刻的保存条件，不利于鸡群ms的检测和净化，特别是接种已感染ms的鸡群反而会造成更为严重的临床症状，这对于我国大部分鸡群为ms阳性的家禽养殖业来说，该疫苗不适合在国内推广应用。另一方面，ms灭活疫苗可以降低ms的感染率，具有一定的保护效果，但其存在免疫保护力较弱、支原体培养成本高等缺点都阻碍了该疫苗的应用。因此，研发一种安全高效的新型疫苗扼制鸡滑液囊支原体病的传播势在必行。
5.磷酸丙酮酸水合酶(phosphopyruvate hydratase，简称ppht)和ⅱ型果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(fructose-1,6-bisphosphate aldolase,class ii，简称fba
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)都是涉及糖代谢途径的关键调控酶，除了在糖代谢中发挥酶活作用外，还以免疫原性膜蛋白成分分布于多种病原菌的细胞膜上且作为毒力因子参与感染的过程，推测它们在ms中也发挥着类似的功能。因此，制备包含以上两种蛋白的组合疫苗，以期有效防控ms的感染是禽业生产和科研人员的殷切期望。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种鸡滑液囊支原体亚单位疫苗，用于鸡滑液囊支原体病的免疫预防。本发明的构思是基于通过原核表达系统表达的鸡滑液囊支原体ppht和fba
‑ⅱ
重组蛋白可被鸡滑液囊支原体阳性血清特异性识别且具有良好的反应原性，说明它们具有极好的免疫原性，以此制备包含以上两种蛋白的组合疫苗，以期有效防控鸡滑液囊支原体的感染。目前尚无商品化的用于预防鸡滑液囊支原体病的亚单位疫苗，也尚无鸡滑液囊支原体ppht和fba
‑ⅱ
作为抗原制备疫苗的报道，使用通过原核表达系统表达的鸡滑液囊支原体ppht和fba
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重组蛋白制备的亚单位疫苗防控该病的流行，为鸡滑液囊支原体
疫苗的研发提供了一种安全高效的亚单位疫苗。
7.本发明的目的在于提供一种新型鸡滑液囊支原体ppht和fba
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蛋白亚单位疫苗及其制备方法与应用。
8.为了实现本发明的目的，本发明提供一种重组表达载体，其含有目的基因片段，目的基因片段包含鸡滑液囊支原体ppht蛋白编码基因，所述的目的基因片段的序列为经密码子优化得到的如seq id no:1所示的序列。
9.作为优选，所述鸡滑液囊支原体ppht蛋白编码基因的3’端连接6
×
his标签肽序列，而5’端依次连接s-tag标签肽序列和trxa标签肽序列。
10.作为优选，所述重组表达载体为在t7terminator序列和lac operator序列之间插入目的基因片段的pet-ppht载体。
11.为了实现本发明的目的，本发明提供一种重组表达载体，其含有目的基因片段，目的基因片段包含鸡滑液囊支原体fba
‑ⅱ
蛋白编码基因，所述的目的基因片段的序列为经密码子优化得到的如seq id no:5所示的序列。
12.作为优选，所述鸡滑液囊支原体fba
‑ⅱ
蛋白编码基因的3’端连接6
×
his标签肽序列，而5’端依次连接s-tag标签肽序列和trxa标签肽序列。
13.作为优选，所述重组表达载体为在t7terminator序列和lac operator序列之间插入目的基因片段的pet-fba
‑ⅱ
载体。
14.为了实现本发明的目的，本发明提供一种免疫原性组合物，其包括：如seq id no:3所示的ppht蛋白，和如seq id no:5所示的fba
‑ⅱ
蛋白，及药学上可接受的载体。
15.本发明提供的新型鸡滑液囊支原体ppht和fba
‑ⅱ
蛋白亚单位疫苗，其包含上述免疫原性组合物，任选包含佐剂。
16.优选地，所述佐剂为水包油包水型佐剂。
17.更优选地，所述佐剂为summit p168佐剂。
18.所述的亚单位疫苗为蛋白液和佐剂乳化后的混合液，蛋白液中ppht和fba
‑ⅱ
蛋白的质量比为1:1，蛋白液与佐剂的体积比为3：2。
19.本发明提供所述新型鸡滑液囊支原体ppht和fba
‑ⅱ
蛋白亚单位疫苗的制备方法，包括以下步骤：
20.(1)参照genbank上公布的核苷酸序列seq id no:2所示的鸡滑液囊支原体的ppht基因序列，和核苷酸序列seq id no:6所示的鸡滑液囊支原体的fba
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基因序列，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，人工合成ppht和fba
‑ⅱ
目的基因，合成的目的基因的核苷酸序列分别如seq id no:1和seq id no:5所示；
21.(2)将目的基因分别重组到puc57载体上，得到重组质粒puc57-ppht和puc57-fba
‑ⅱ
，分别以puc57-ppht和puc57-fba
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重组质粒为模板进行pcr扩增反应，所述扩增体系为2
×
phanta max buffer 25μl，dntp mix 1μl，上、下游引物各2μl，模板2μl，phanta max super-fidelity dna polymerase 1μl，加dd h2o补充至50μl；反应程序：95℃预变性3min，94℃变性20sec，60℃退火20sec，72℃延伸1min，进行35个循环扩增，72℃延长5min；扩增产物于1％琼脂糖凝胶电泳，并凝胶回收目的片段，得到目的基因，-20℃保存；重组质粒puc57-ppht对应的上、下游引物的序列如seq id no:9、seq id no:10所示，重组质粒puc57-fba
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对应的上、下游引物的序列如seq id no:11、seq id no:12所示；
22.(3)使用clonexpress multis one step cloning kit的重组酶exnase将目的基因ppht和fba
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分别连接至pet-32a载体，将连接产物转化e.coli dh5α感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素抗性的lb平板，37℃培养12～16h，挑取单菌落分别接种lb培养基，通过pcr与测序鉴定重组质粒，重组质粒分别命名为分别命名为pet-ppht、pet-fba
‑ⅱ
；
23.(4)将构建的重组质粒转化大肠杆菌e.coli bl21，pcr鉴定阳性菌株，利用itpg诱导阳性菌株表达ppht和fba
‑ⅱ
蛋白。
24.(5)对重组表达的ppht和fba
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蛋白进行纯化得到的蛋白液按ppht和fba
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蛋白的质量比为1:1混合，得到的混合蛋白液中ppht和fba
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蛋白的浓度均为167μg/ml，加入混合蛋白液2/3体积的summit p168佐剂充分混匀。
25.本发明提供的所述新型鸡滑液囊支原体ppht和fba
‑ⅱ
蛋白亚单位疫苗的应用：用于制备治疗或预防鸡滑液囊支原体感染的药物。
26.前述的方法，步骤(5)包括：阳性菌株均接种于10ml的lb液体培养基中，37℃培养至对数生长期，按1:100的接种比例转接至1l lb液体培养基中，37℃培养至od600值为0.8，加入终浓度0.5mmol/l的iptg于20℃诱导8～12h。
27.采用上述方案后，本发明与现有技术相比较具有以下突出的优点和效果：用于预防鸡滑液囊支原体病的灭活疫苗存在免疫保护力较弱、灭活过程中可能存在灭活不彻底的风险等问题，而且支原体培养具有成本高、工艺复杂、存在扩散的风险等缺点也阻碍了灭活疫苗的制备。
28.本发明采用原核表达系统表达ppht和fba
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蛋白，具有抗原易于获取、免疫效果好、工艺安全简单、成本低廉、易于规模化生产等优点。本发明的优点在于通过原核表达系统表达ppht和fba
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蛋白，表达水平高，适用于大规模生产。表达产物可被ms阳性血清特异性识别且具有良好的反应原性，说明它们具有极好的免疫原性。
29.本发明使用原核表达系统表达的ppht和fba
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蛋白，表达产物的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似。制备的疫苗能产生较高水平的抗体，抗体激发快，持续时间长。免疫后，对鸡无致病性，明显减少了鸡滑液囊支原体病的发病率。相比传统的灭活疫苗，本发明的基因工程亚单位疫苗具有抗原易于获取、免疫效果好、工艺安全简单、成本低廉、易于规模化生产等优点。
附图说明
30.图1为ppht基因pcr扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为阴性对照；2为ppht基因；m为分子量标记；
31.图2为ppht基因转化的菌落样品pcr扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为阴性对照；2～6为ppht基因转化的菌落样品pcr扩增产物；m为分子量标记；
32.图3为fba
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基因pcr扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为阴性对照；2为fba
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基因；m为分子量标记；
33.图4为fba
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基因转化的菌落样品pcr扩增产物进行凝胶电泳结果；其中1为阴性对照；2～6为fba
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基因转化的菌落样品pcr扩增产物；m为分子量标记；
34.图5为构建的重组原核表达载体pet-ppht图谱；
35.图6为构建的重组原核表达载体pet-fba
‑ⅱ
图谱；
36.图7为实施例3中表达的重组ppht蛋白进行sds-page垂直电泳的结果，其中1为阴性对照；2为破碎后的沉淀；3为破碎后的上清；m为分子量标记；
37.图8为实施例3中表达的重组fba
‑ⅱ
蛋白进行sds-page垂直电泳的结果，其中1为阴性对照；2为破碎后的沉淀；3为破碎后的上清；m为分子量标记；
38.图9为实施例3中表达的重组ppht蛋白进行western blot的结果，其中1为阴性对照；2为纯化回收的ppht蛋白；m为分子量标记；
39.图10为实施例3中表达的重组fba
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蛋白进行western blot的结果，其中1为阴性对照；2为纯化回收的fba
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蛋白；m为分子量标记；
40.图11为使用本发明疫苗后，攻毒后阴性对照组与疫苗组鸡爪垫、跗关节和肝脏病变的对比结果。
具体实施方式
41.下面结合具体实施案例来进一步描述本发明。本领域的技术人员应该理解的是在不偏离本发明精神和范围的前提下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。
42.首先对本发明所设计的术语解释如下：
43.术语“puc57”是大肠杆菌克隆质粒，大小为2710bp，含有氨苄抗生素抗性基因，能在含有氨苄的lb培养基上生长，是一个高拷贝质粒载体，可用于蓝白斑筛选。puc57 mcs包括6个具有突出3’端的限制性位点，该末端可耐受大肠杆菌核酸外切酶iii。
44.术语“max super-fidelity dna polymerase”指南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供的“最强模板兼容性的新一代高保真dna聚合酶”。“2
×
phanta max buffer”为南京诺唯赞生物科技股份有限公司提供的高保真pcr缓冲体系,用于配套phantasuper-fidelity dna polymerase(p505)使用。“dntp mix”(dntp混合物)是含有datp、dctp、dgtp和dttp的钠盐的预混溶液，各自的浓度为10mm，总浓度为40mm(ph7.5)。
45.术语“dh5α感受态细胞”：dh5α菌株是实验室最常用的感受态细胞。缺失核酸内切酶(enda)，提高了质粒dna的产量和质量；重组酶缺陷型(reca)减少插入片段的同源重组概率，保证了插入dna的稳定性；laczδm15的存在使dh5α可用于蓝、白斑筛选。
46.术语“od600”：指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值。吸光值正比于溶液中的吸光物质的浓度，相应地与样品的透过率t值成反比，在数值上来说，它们之间是对数关系。细菌的生长比较好的时期是在od600为1时，此时可以进行转代等研究，在细菌的培养中，od600超过0.8就要稀释培养基。
47.术语“iptg”：异丙基-β-d-硫代半乳糖苷是一种有机物，化学式为c9h18o5s，是异乳糖模拟物，能够引起乳糖操纵子的转录过程，因此能够诱导乳糖操纵子下游基因对应蛋白的表达。
48.术语“western blot鉴定”采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
49.术语“羊抗鸡多克隆抗体二抗”是由高纯鸡igy免疫山羊，以所得的高效价抗体的山羊免疫血清(抗血清)为原料,采用鸡igy免疫亲和层析方法纯化,制成高纯度(≥95％)高活性的纯化羊抗鸡igy抗，igy对哺乳动物抗原的反应度(sensitivity)高，igy普遍存在于鸟类、爬行动物和两栖类，在功能上等价于哺乳动物igg。
50.实施例1表达载体pet-ppht的构建与鉴定
51.1.ppht基因的扩增与回收参照滑液囊支原体wvu 1853株(genbank no.cp011096.1)的ppht基因序列(seq id no:2所示)，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，由北京擎科生物科技有限公司人工合成seq id no:1所示的基因序列，并重组到puc57载体上，得到puc57-ppht质粒载体。人工合成序列seq id no:1与genebank公布的ppht基因序列seq id no:2具有76.62％的一致性；seq id no:1翻译的氨基酸序列为seq id no:3，与seq id no:2翻译的氨基酸序列seq id no:4具有100％的一致性。
52.以puc57-ppht质粒作为模板，通过ppht-f、ppht-r引物(ppht-f、ppht-r引物序列如seq id no:9、seq id no:10所示)按照南京诺唯赞生物科技有限公司max super-fidelity dna polymerase进行pcr扩增。扩增体系和反应程序如表1所示：
53.表1 ppht基因扩增体系和反应程序pht基因扩增体系和反应程序
54.pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的基因大小如图1所示，在1356bp位置出现目的条带，表明目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
55.2.pet-32a载体的酶切与回收将提取的pet-32a质粒使用bamh i和hind iii限制性内切酶进行双酶切，将酶切产物进行凝胶电泳，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
56.酶切体系pet-32a质粒10μl，10
×
k buffer 5.0μl，bamh i酶2.0μl，hind iii酶
2.0μl，加dd h2o补充至50μl。
57.反应条件37℃过夜酶切。
58.3.连接使用南京诺唯赞生物科技有限公司clonexpress multis one step cloning kit的重组酶exnase将回收纯化的ppht基因片段与pet-32a质粒片段连接。
59.连接体系pcr回收产物1μl，pet-32a质粒回收片段1μl，5
×
ce
ꢀⅱꢀ
buffer 2.0μl，exnase
ꢀⅱꢀ
1μl，加dd h2o补充至10μl。
60.反应条件37℃连接30min。
61.4.转化将连接产物加入100μl的dh5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90sec后迅速置于冰里静置5min，加入500μl无抗性lb液体培养基(luria-bertani培养基)，37℃培养1h。将菌液浓缩至100μl涂布于含氨苄青霉素抗性的lb固体培养基上，37℃培养12～16h左右。
62.5.pcr与测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种lb液体培养基，37℃培养2h。以菌液作为模板，通过ppht-f、ppht-r引物进行pcr鉴定，pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的基因大小如图2所示，在1356bp附近出现条带的样品为阳性菌株。将阳性菌株送北京擎科生物科技有限公司进行测序，从而构建出重组载体pet-ppht。载体图谱示意图如图5所示，具有以下元件：复制子：ori——起始载体的复制；f1 ori—f1噬菌体复制子，显示正义链合成方向；rop：编码rop蛋白，使得质粒维持低拷贝水平；乳糖操纵子元件——laci promoter+ laci(启动阻遏蛋白的表达，是lac operator的抑制因子)，lac operator(lac操纵基因，阻遏蛋白与之结合后抑制其后基因的表达，乳糖类似物iptg可与阻遏蛋白结合从而失去对lac operator的控制，进而使得其后基因正常表达)；t7 promoter：受控于t7 rna聚合酶的启动子，是当今大肠杆菌表达系统的主流。强大的t7启动子完全专一受控于t7 rna聚合酶，而高活性的t7 rna聚合酶合成mrna的速度比大肠杆菌rna聚合酶快5倍，当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过t7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；6xhis(6xhis亲和标签)：编码6个连续的his，用来作为纯化目标蛋白的标签；s-tag：是一段来源于胰腺核糖核酸酶a(rnase a)n末端的短肽，通常将s-tag构建到目的蛋白的n末端或c末端上，以便可以使用免疫化学方法分析s-tag标记的蛋白，这种s-tag蛋白可通过商业化的s-tag抗体检测；trxa：用于促进重组蛋白的可溶性表达；ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
63.实施例2表达载体pet-fba
‑ⅱ
的构建与鉴定
64.1.fba
‑ⅱ
基因的扩增与回收参照滑液囊支原体wvu 1853株(genbank no.cp011096.1)的fba
‑ⅱ
基因(seq id no:6所示)，根据大肠杆菌密码子的偏爱性，由北京擎科生物科技有限公司人工合成seq id no:5所示的基因序列，并重组到puc57载体上，得到puc57-fba
‑ⅱ
质粒载体。人工合成序列seq id no:5与genebank公布的fba
‑ⅱ
基因序列seq id no:6具有78.70％的一致性；seq id no:5翻译的氨基酸序列为seq id no:7，与seq id no:6翻译的氨基酸序列seq id no:8具有100％的一致性。
65.以puc57-fba
‑ⅱ
质粒作为模板，通过fba
‑ⅱ‑
f、fba
‑ⅱ‑
r引物(fba
‑ⅱ‑
f、fba
‑ⅱ‑
r基因序列如seq id no:11、seq id no:12所示)按照南京诺唯赞生物科技有限公司max super-fidelity dna polymerase进行pcr扩增。扩增体系和反应程序如表2所示：
66.表2 fba
‑ⅱ
基因扩增体系和反应程序
67.pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的基因大小如图3所示，在864kbp位置出现目的条带，表明目的基因扩增成功，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
68.2.pet-32a载体的酶切与回收将提取的pet-32a质粒使用bamh i和hind iii限制性内切酶进行双酶切。将酶切产物进行凝胶电泳，用凝胶回收纯化试剂盒进行回收纯化。
69.酶切体系pet-32a质粒10μl，10
×
k buffer 5.0μl，bamh i酶2.0μl，hind iii酶2.0μl，加dd h2o补充至50μl。
70.反应条件37℃过夜酶切。
71.3.连接使用南京诺唯赞生物科技有限公司clonexpress multis one step cloning kit的重组酶exnase将回收纯化的fba
‑ⅱ
基因片段与pet-32a质粒片段连接。
72.连接体系pcr回收产物1μl，pet-32a质粒回收片段1μl，5
×
ce
ꢀⅱ
buffer 2.0μl，exnase
ꢀⅱ
1μl，加dd h2o补充至10μl。
73.反应条件37℃连接30min。
74.4.转化将连接产物加入100μl的dh5α感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90sec后迅速置于冰里静置5min，加入500μl无抗性lb液体培养基，37℃培养1h。将菌液浓缩至100μl涂布于含氨苄青霉素抗性的lb固体培养基上，37℃培养12～16h左右。
75.5.pcr与测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种lb液体培养基，37℃培养2h。以菌液作为模板，通过fba
‑ⅱ‑
f、fba
‑ⅱ‑
r引物进行菌落pcr鉴定，pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，目的基因大小如图4所示，在864bp附近出现条带的样品为阳性菌株。将阳性菌株送北京擎科生物科技有限公司进行测序，从而构建出重组载体pet-fba
‑ⅱ
。载体图谱示意图如图6所示。具有以下元件：复制子：ori——起始载体的复制；f1 ori—f1噬菌体复制
子，显示正义链合成方向；rop：编码rop蛋白，使得质粒维持低拷贝水平；乳糖操纵子元件——laci promoter+ laci(启动阻遏蛋白的表达，是lac operator的抑制因子)，lac operator(lac操纵基因，阻遏蛋白与之结合后抑制其后基因的表达，乳糖类似物iptg可与阻遏蛋白结合从而失去对lac operator的控制，进而使得其后基因正常表达)；t7 promoter：受控于t7 rna聚合酶的启动子，是当今大肠杆菌表达系统的主流。强大的t7启动子完全专一受控于t7 rna聚合酶，而高活性的t7 rna聚合酶合成mrna的速度比大肠杆菌rna聚合酶快5倍，当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过t7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；6xhis(6xhis亲和标签)：编码6个连续的his，用来作为纯化目标蛋白的标签；s-tag：是一段来源于胰腺核糖核酸酶a(rnase a)n末端的短肽，通常将s-tag构建到目的蛋白的n末端或c末端上，以便可以使用免疫化学方法分析s-tag标记的蛋白，这种s-tag蛋白可通过商业化的s-tag抗体检测；trxa：用于促进重组蛋白的可溶性表达；ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。
76.实施例3重组蛋白ppht和fba
‑ⅱ
的表达与纯化
77.1.载体转化表达菌株将实施例1和实施例2构建的重组质粒和pet-32a(+)空载体转化至大肠杆菌感受态细胞e.coli bl21中，pcr鉴定阳性菌株。
78.2.重组菌株的诱导表达利用itpg诱导实施例3构建的阳性菌株表达ppht和fba
‑ⅱ
蛋白。将重组阳性菌株均接种于10ml的lb液体培养基中，37℃培养至对数生长期，按1:100的接种比例转接至1l lb液体培养基中，37℃培养至od600值为0.8，加入终浓度0.5mmol/l的iptg于20℃诱导8～12h。异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)，是异乳糖模拟物，能够引起乳糖操纵子的转录过程，因此能够诱导乳糖操纵子下游基因对应蛋白的表达。在大肠杆菌外源基因的诱导表达中，可以实现目的蛋白的大量表达。
79.3.重组蛋白sds-page检测离心收集菌体，用适量pbs缓冲液重悬，使用超高压纳米均质机以800～1000bar压力破碎3次，离心收集沉淀和上清，得破碎沉淀和破碎上清。分别将诱导后的阴性对照菌液、诱导后的阳性菌体破碎沉淀和破碎上清加入适量的蛋白上样缓冲液，煮沸10min，进行sds-page(聚丙烯酰胺凝胶电泳)垂直电泳。完成电泳后，取下凝胶放入考马斯亮蓝染色液中充分浸没，进行过夜染色，再倒出染色液，然后加入考马斯亮蓝脱色液，充分覆盖凝胶，进行脱色，观察蛋白是否表达。如图7和图8所示，ppht和fba
‑ⅱ
重组蛋白均可在上清表达，分别在分子量约为68kda和分子量约为50kda的位置有条带，与预期蛋白大小相符，阴性对照在相应位置无条带。
80.4.重组蛋白western blot鉴定选择破碎上清样品做western blot鉴定，将sds-page电泳产物转印到nc(硝酸纤维素)膜上，先用5％脱脂奶粉封闭2h，加入鸡源抗ms阳性血清过夜孵育，漂洗，加入hrp(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鸡多克隆抗体二抗(abbkine公司)孵育2h，漂洗，加入增强型化学发光荧光底物显色，观察有无目的条带，分析重组蛋白的免疫原性。如图9和图10所示，ppht和fba
‑ⅱ
重组蛋白均可与ms阳性血清发生反应，分别在分子量约为68kda和分子量约为50kda的位置显影，证明其反应原性良好，说明它们具有极好的免疫原性。
81.5.蛋白纯化将本实施例步骤3中的破碎上清使用镍柱纯化，咪唑洗脱，从而得到重组蛋白液。用bca法检测蛋白浓度，其中，重组蛋白ppht浓度为1654μg/ml，fba
‑ⅱ
浓度为1860μg/ml，蛋白液经过0.22μm滤膜无菌过滤，4℃保存。
82.实施例4疫苗的制备
83.取实施例3步骤5中过滤除菌后的ppht蛋白60.58ml，fba
‑ⅱ
蛋白53.87ml进行混合，并使用灭菌水补充至600ml，则每种抗原蛋白浓度为167μg/ml，然后将混合好的蛋白液与佐剂summit p168佐剂按3:2比例均匀混合配制成疫苗。佐剂summit p168购自漯河桑米特生物科技有限公司，为禽流感疫苗专用水包油包水佐剂，主要成份:药物级白油、界面活性剂、免疫促进剂；具体的，每600ml混合蛋白液加入佐剂summit p168400ml，然后用乳化仪10000rpm乳化10min，将蛋白相与佐剂相形成均一乳剂。
84.实施例5免疫实验
85.将实施例4中制备好的鸡滑液囊支原体亚单位疫苗分别以0.5ml颈部皮下注射7日龄spf鸡(spf生产用鸡指生长在屏障系统或隔离器中，无国内外(尤其是国内)流行的鸡主要传染性病原，具有良好的生长和繁殖性能的鸡群)各10只，另设不免疫对照10只。免疫后14日进行二次相同剂量的免疫。
86.二次免疫后14日，各组试验鸡采用爪垫接种活菌量约106ccu/ml的鸡滑液囊支原体培养物0.2ml，观察14日内试验鸡发病情况。结果对照鸡全部(10/10)发病，出现精神不振，生长停滞，关节肿胀、跛行，甚至变形；解剖鸡跗关节，出现化脓性的渗出物；剖检可见肾脏肿大(如图11所示)。免疫鸡1只发病，保护率为9/10，疫苗免疫效力合格。
87.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
88.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。